台灣海洋細菌的研究 (6) 海洋細菌分類學(Taxonomy)

必也正名乎

小子曰:「小子待師而實驗,師將奚先?」
 曰:「必也正名乎!」
小子曰:「有是哉,師之迂也!奚其正?」
 曰:「野哉小子也!吾等於其所不知,蓋闕如也。名不正,則言不順;言不順,則事不成;事不成,則Paper不登;Paper不登,則計畫不過;計畫不過,則吾等無所措手足。故細菌名之必可言也,言之必可行也。吾等於其言,無所苟而已矣。」
這是微生物分類實驗室的寫照,替未知微生物分類與命名(或正名),關係到實驗室的存活,paper 發不去,計畫當然爭取不到,實驗室接著關閉,老師也就喝西北風去了!但是細菌的正名工作容易嗎?其實它的前置準備工作是很累人的。

これは何ですか?

 大多數人對於沒見過的生物,會提出 這是什麼? 的疑問,接著會繼續追問:
   能吃嗎? (有毒否?)
   好吃嗎?
   有什麼功用?
   從那兒來的?
   怎麼生存?
   如何培養、繁殖?……
以上是看似簡單的問題,若想要精確地回答,則必須要對此物種的形態、生理、生化機能、遺傳和生態等有一定程度的瞭解,才能提出令人滿意的答案,而上述這些知識和技能都包括在分類學(taxonomy)的範疇內。

分類學是一門解答人們對於物種疑惑的科學,簡而言之,其目的是告訴您:它是什麼東西!(正名)。分類學主要根據個別物種的特性 (characteristic,或稱特徵),把相近者予以歸類在同一分群中,反之透過了解分類群的某一成員的特徵,可以假設同一群體的其他成員亦可能具有相似的特徵。基於上述的原則,自環境中取得任何未知的生物樣本,學者必須藉由特性的比對,判斷樣本為何物種或近似何物種,進而瞭解它是否有開發或利用的價值。
一般而言,大型生物多以外觀(表型, phenotype)特徵即可達到初步鑑定種類(鑑種)和分類的目的,然而肉眼無法辨識的微生物,其鑑種工作著實相當繁雜。以細菌而言,不管是形成清晰可見的菌落或是在顯微鏡下的細胞,其樣態並無太大的變化,從事微生物的工作者必須利用許多工具和方法,將它們的特性表列出來,再加以分門別類,達到鑑種的目的。譬如:人體受到細菌感染,醫生必先採取病人樣本,進行細菌培養與快速鑑定,如此才能正確用藥,達到治療的目標,如果盲目地用藥,不僅病人無法康復,亦可能會造成其它不良的副作用。

細菌分類學(Taxonomy)內涵

 1968Cowan對細菌的分類學做了相當好的解釋,他認為Taxonomy包含三個項目:
  1. 分類(Classification)對分類單元進行順序的安排,編進較大的群組。
  2. 命名(Nomenclature):對被確定的分類單元貼標籤,也就是給予
  3. 鑑定(Identification):將未知物知分類種進行特性(特徵)對,確定後予以貼標籤(給予種名或屬名)
  基本上,鑑定是分類和命名的實際應用,而這三項目構成分類學。但隨著生命科學的進步,有許多學者認為除了上個項目外,應該還需加上演化及系統發生的要件,對細菌分類學才會有比較完整的論述,因而提出系統分類學(Systematics)的概念。但也有人認為分類學與系統分類學所代表的詞意是相同的。

Taxonomy包含CharacterizationIdentificationClassification三個項目。Characterization為分類學的前置作業,它包含所有檢測細菌特性的調查和實驗工作。


特性檢測(Characterization)

由上圖可以看出,分類學多屬資料分析比對的工作,相較於在它之前特性檢測,後者顯然才是繁重和複雜的實作項目,它主要把細菌細胞從裏到外,任何可以表現出它與眾不同的特點找出來,資料俱足後,才進入分類學領域,與已知菌種進行比對分析,達到分類鑑定的目的。細菌的特性大致上可以分成幾個項目:
1.Morphological characteristics
2.Chemical composition
3.Cultural characteristics
4.Metabolic characteristics
5.Antigenic characteristics
6.Genetic characteristics
7.Pathogenicity
8.Ecological characteristics

海洋細菌之特性檢測(Characterization)實作項目

1. 細胞和菌落形態觀察
(1)菌落的諸類形態學觀察(肉眼,解剖顯微鏡檢);分離株細胞的相位差和電子顯微鏡觀察。
(2)實測項目包括:菌外型、色素產生、擴散性(swarming)、革蘭氏反應(Gram reaction,細胞切片等。
2. 細菌分離株生長特性之檢測
(1)分離株對於鈉離子需求性、pH、溫度、醣醇類的利用性、氧氣需求性。
(2)實測項目包括:單一碳源測試(L-阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露 糖、蔗糖、木糖。甘露醇、肌醇、檸檬酸、延胡索酸、乳酸)、醣類發酵測試(測試碳源與單一碳源測試相同)
3. 分離株之生理、生化特性之檢測
(1)各類檢測方法可以參照Shieh et al (1998)Gerhardt et al. (1994)Kelly et al. (1991)Smibert & Krieg (1994)等論述
(2)實測項目包括:觸酶(catalase)、氧化酶(oxidase)、 洋菜水解酶(agarase)、澱粉酶(amylase)、去氧核糖核酸酶(DNase)、 七葉靈酶(esculinase)、明膠酶(gelatinase)、解脂酶(lipase)、蛋白酶(protease)、精胺酸雙水解酶(L-arginine  dihydrolase)、賴胺酸去羧酶(L-lysine decarboxylase)、鳥胺酸去羧酶(L-ornithine decarboxylase)、脫 氮反應測試、吲朵(indole)生成、硫化氫(H2S)生成、硝酸還原測試。
4.分離株化學分類檢測:
(1)G + C含量:
(2)細胞脂肪酸組成:
(3)細胞膜醌組成:
(4)Polar lipid
5. 親緣分析
(1)16S rRNA基因(16S rDNA)定序與分析。
(2)16S rDNARFLP分析。

簡易海洋細菌分類、鑑定流程圖。



後記:

《論語•子路第十三》子路問孔老夫子曰:「衛君待子而為政,子將奚先?」,孔子曰:「必也正名乎!」,末學將此篇改了一些,實有違先人聖訓之要旨,在此先行自懺一番。惟微生物的鑑定和命名著實相當艱辛的工作,每一個檢測項目都要花很多時間和金錢,聚集相當資料後,才能判斷它是誰!,之後,才能決定捨棄或進一步研究。誠如日片”君の名は”,當你忘了對方的名,要在茫茫人海中再度相遇,何其困難,倘若知道了名字,呵…用古歌大神或許就沒問題了!

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台灣海洋細菌的研究 (5) 海洋細菌培養基 (Culture Media)


養菌之題外

嬰仔嬰嬰睏一暝大一吋
嬰仔嬰嬰惜一暝大一尺
搖囝日落山抱囝金金看
你是我心肝驚你受風寒……
(摘自:搖嬰仔歌;作詞:蕭安居/廬雲生作曲:呂泉生)

這是一首給母親唱的歌,每次末學把接種完成的培養皿或試管置入培養箱時,心中大多會浮現此歌的旋律。養菌跟養小孩一樣,要提供它最好的食物和最好的生活環境,而且還要時刻照料,希望它們能夠平平安安、快快長大,為主子爭光去。

細菌的營養型態

地球上的生物都需要攝取營養來維持其生命與生長,動物需要蛋白質、醣類、脂肪、維生素和礦物質等;植物所需要素以氮、磷、鉀為主;細菌則是一群特殊的生命,因為各自的營養型態不一樣,所以需要的養分差異很大。因此,針對不同的菌種,把必要的成分調製在培養基中,這樣才能提供這些小生命完整的營養。學者依營養(獲得能量)型態,將細菌分為幾個類別如圖所示:



對症下藥

看完上圖所分類的細菌營養型後,怎樣針對目標菌種,調配出適合的培養基,可能仍是一頭霧水。還好,許多專家已經把各類型的培養基成分公告在各種不同的專業期刊上,您只要細心的去找,一定能夠尋獲適合的培養基配方。譬如:培養海洋異營性細菌最著名的培養基為Marine Broth 2216 (Marine Agar 2216),此培養基的配方係仿照海水的成分,把一些看似微量成分都加進來,其主要目的是想把大部分的異營性細菌都培養出來 (但是事與願違,容後再述)

Marine Broth 2216

Yeast Extract
1.0 g
Peptone
5.0 g
Ferric Citrate
0.1 g
Sodium Chloride
19.45 g
Magnesium Chloride
5.9 g
Magnesium Sulfate
3.24 g
Calcium Chloride
1.8 g
Potassium Chloride
0.55 g
Sodium Bicarbonate
0.16 g
Potassium Bromide
0.08 g
Strontium Chloride
34.0 mg
Boric Acid
22.0 mg
Sodium Silicate
4.0 mg
Sodium Fluoride
2.4 mg
Ammonium Nitrate
1.6 mg
Disodium Phosphate
8.0 mg
H2O
1 Liter
Agar*
15.0 g
*, only for Marine Agar 2216.


仔細察看Marine Broth 2216的成分,NaCl的量僅有19.45 g,遠低於海水實際的鹽度。為什麼會這樣?不是要仿照海水的成分嗎?其實大多海洋細菌最喜歡的鹽度並不是3.5 %,而是2.0-2.5 %左右,而且Marine 2216的成分中含有高量的二價Mg2+ Ca2+,根據許多研究指出,這兩種離子可以取代Na+。因此,將這些成分加成後,也就符合考慮培養基配製的邏輯了。

再舉一個例子,如下表NS-I medium,分析其成分,NaCl計有20g,應是海洋細菌的培養基;碳源僅為glucose,表示它是一種簡單培養基(或稱為單一碳源培養基);氮源部分,僅有NH4Cl,並無蛋白質成分提供氮源,但若把NH4Cl改為yeast extract (YE, 酵母萃取物),它就變成是一種複合培養基了,因為YE含有整個酵母成分,包含蛋白質、醣類 (碳源)、微量元素和其它營養成分。

NS-I medium

(a)

NH4Cl*
10mg
NaCl
20 g
MgSO4.7H2O
0.5 g
CaCl2
10 mg
FeCl3.6H2O
5m g
MOPSO (Sigma)
4.5 g (20 mmol)
Deionized water
850 ml
pH  7.0

(b)

K2HPO4
0.2 g
Deionized water
50 ml
(c)

Glucose
5 g
Deionized water
100 ml
* NS-II medium:將NS-I medium中之NH4Cl
yeast extract (20 mg)取代。

末學最常用的異營性細菌培基為Polypepton-yeast broth (PY broth),其成分簡單 (如下表),容易配製,而且符合標的菌種的需求。


Polypepton-yeast broth (PY broth)
Polypepton (Daigo, Tokyo)
2.0 g
Bacto-yeast extract (Difco)
0.5g
NaCl
20.0 g
MgCl2.6H2O
5.0 g
Agar*
15.0 g
Agar**
5.0 g
Distilled water
1000 ml
pH 
7.0
**, only for PY stab.   *, only for PY-agar plate.

培養實作

海洋細菌培養實作過程,首先要先把樣本取回 (採樣),再進行實驗室內的處理,其摘要如下:
(1) 培養基
本研究所採用之培養基共計二種:1 PY平板培養基用於異營性細菌計數及增菌培養;2 PYG 平板培養基則用於海洋弧菌計數及增菌培養
(2) 採樣和細菌計數
本研究在港區(人工潮池、人工沙灘及突提等工程)分設數個測站,在這些測站採集底泥樣本後,於低溫下迅速帶回實驗室,利用NaCl-Tris緩衝液(1.5% NaCl+10mM Tris, pH 8.0),將水樣以10的倍率多個階段稀釋。並儘速進行以下處理:
A.平板計數
(A)異營性細菌生菌數
取各樣品之原液和不同倍率稀釋水各0.1 mL,依序塗PY平板培養基上,再置入30 (培養時間及溫度可再考量)培養箱中,在好氣條件下培養一星期後,觀察並記錄 PY 培養基上之菌落總數。
(B)海洋弧菌生菌數
承上述(A)法,將PY培養基改為PYG培養基,並改以嫌氣條件(利用anaerobic jar)培養三日後,觀察並記錄培養基上之菌落總數。
B. MPN 計數
(A)異營性細菌
a.取各樣品之原液和不同倍率稀釋水各1 ml(稀釋水取稀釋101-105倍者),分別接種於PY液體培養基中。
b.接種後之PY液體培養基之培養系列分別置於好氣條件下培養15-18小時。培養溫度設定為30℃。
c.觀察培養液生長之有無(即液體培養基是否呈現明顯混濁)根據培養管系列混濁的數目及分布情形,查表即可估得各水樣品中異營性細菌的最大可能菌數(Most Probable Number, 簡稱MPN)
(B)海洋弧菌計數
仿異營性細菌計數法,僅將培養基改為PYG,而培養條件改為嫌氣培養。
 (3) 菌株之分離與保存
於上項2PYPYG 平板培養基中挑選形態相異之菌落,用連續劃線法加以純化,確認為純菌後,接種於PY高層培養基中,並置於20℃恆溫箱中行繼代保存;繼代保存每三~四個月進行一次。

培養基的設計非常重要,關係到實驗的成果,而且由培養基的成分,也約略可看出菌種的特性。有志於微生物領域的學子,應該要好好學習這門功課。

  培德積功心牢記
  養性修心身力行
  基穩礎固道不離
  成敗是非意勿執
  秒須念轉空
  經暗意理自解
  理妙學靈可通
  盡仁至功大成


後記:

當年實驗室比較窮,一瓶Marine 2216 (500 g)要價台幣4,500塊,以末學的認真度,大概幾次實驗就用光了,因此只得自己配置,光看到那個配方,就頭大,而且每次用的量都不一樣,得重新計算過。後來,終於有比較佛心的廠商出產價格比較低廉產品,這才解決困擾。


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台灣海洋細菌的研究之番外篇(3). 為菌嚐藥


題外

人可以粗略分為兩種,一種没有自信,另外一種是有自信(就如柯P常講:一種是有插管,另一種是没有插管的),當然這兩類人是可以再細分,譬如有自信的人在程度上會有自信滿滿,有點自信等等的區分   (但插管的就不能分成全插或半插囉)。自信滿滿的人,有時候會變成呼六 (唬爛) 的人,他們常常會把話說滿了,但真正操作的時候,卻又胡亂瞎搞。在此呼,没有自信的人絕對不要進實驗室!

玻璃,心易碎

 話說,進微生物實驗室,第一要先摸清洗試管的奧義   (此處再強調一次);第二步學會配培養基(以下簡稱:配藥)。第三接種菌株;第四

配藥的工作,說難不難,只要照著配方走,好比煮菜一般,醬油一茶匙,鹽一小匙,糖一大匙……最後再試鹹淡口味,是否符合味覺的極佳感受。雖然這樣比喻,兩者之間還是有一些差別 (譬如:炒菜的 "火候"   很重要,配方雖對,但火候不對,就GG了)。按照培養基配方,把全部材料加入到水中溶解,最後一個步驟是調整pH (酸鹼) (如同試鹹淡口味),只是這步驟必須得用酸鹼檢測計 ( pH meter ) 來探知,並用酸液或鹼液調整pH,直到符合配方的要求。

pH meter 的探針是玻璃製成的,剛進實驗室時,學長就交待要好好對待它,因為不小心,它就會跟你拜別 (當時價格NT$ 1,600,唉玻璃讓心碎)。為了要避免不必要的困擾,每次使用它時,便會戰戰競競,但意外難免發生。在末學還是菜鳥時的幾個月內,大概壓破兩支,變成老鳥後,竟也失手又弄壞一支。根據私人統計,pH meter損壞率是一定的(與夾娃娃機的概念一樣),由此可見,pH meter損壞常會被認真配藥的研究生給碰到 (讚嘆一下自己)


圖左那根有黃色接頭玻璃管,就是pH meter的探針。
(懶得P圖,說真的貼上這張照片,會讓人覺得這間實驗室管理欠妥!)

為菌嚐藥

某一日,進實驗室,甲學弟告知pH meter探針頭又掛了,無法配藥,已訂了新貨,但要幾天才到,只見他收拾包袱,飄然而去。此時,見實驗臺前有一位乙學弟正在配製藥品,只覺他自信滿滿令人震懾 (當年不知,現才懂得 "人到一種境界,會散發出某些能量"  ,今人難以招架),只見他興起緩緩拾起藥匙,舀了一瓢培養液,送入口中,發出嘖....嘖的聲音,接著喊了一聲   "delicious",放下藥匙,配製完成。當下,年輕的末學頗為驚嚇,世上竟有如此性情中人!

做過科學研究的人都知道,在試驗過程中,若有一個步驟出差錯,可能整個試驗都得重來,生命科學的試驗也一樣,非常注重再現性!培養基pH值關係到細菌的存活與增殖,所以配製培養基的SOP是師兄弟間必須傳遞和遵守的規則,這才能保證養得出細菌來。為何這專業學子,會做出這樣的事來?這疑問在末學心中縈繞許久,隨著經驗的累積終究還是解開了!

為什麼?其實,實驗室所指定的培養基成分(藥品)都是固定的,劑量也固定,品牌也固定,那麼溶入水中後,其pH值大概不會變動太大,最多就差個0.1左右了,要調整至正確值,用的酸鹼液量也就固定了,所以這個專業且自信滿滿的學弟,當年的確悟到這個原則,因此在滴入數滴鹼液後,大膽以口試藥,也表明〝人既可食,菌亦可食〞的深奧道理。至今,末學仍佩服不已。有詩讚曰:

古黔婁嘗糞憂親
今學子試藥養菌
天然混成兩難比
才子牽掛只為伊

有人會問:pH值差0.1會不會影響細菌的生長?

末學不負責任並大膽地告訴諸位,百分百會影響,但這個差別您肉眼一定看不出來,用儀器測量也在95%的信赖區間內 (這樣到底有没有影響?)。因為,除了pH值外,實際操作過程中,還有許多因素參雜其中,造成每次培養出現一些差異。

科學農業 -- 智慧型灌溉 (台南官田區)

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