台灣海洋細菌的研究 (7) 細菌鑑定之脂肪酸分析(二)

誠如上回所言，影響細菌脂肪酸組成比例的因素很多，因此要利用它來進行菌株間分類鑑定的比對依據時，必須注意到培養條件的一致性。2010年前，論文審查者大多不太關心上述的問題，但因為工具和標準菌株的取得便利化以後，投稿人進行新菌種發表時，若要將脂肪酸列為主要比對項目，那麼，他們勢必要取得標準菌株，然後在相同培養條件，分析出菌株的脂肪酸組成，以利比對。

表1. 這是由本團隊2012年所發表的新型菌種Kangiella taiwanensis
與其它標準菌株的脂肪酸組成分比較。

脂肪酸萃取方法

細菌脂肪酸的取得係採用全細胞萃取法，即是除了細胞膜上的脂肪酸外，也會將細胞質中的脂肪酸一併取出。過去會為了定量先將細胞冷凍乾燥後，再行萃取，但後來因技術精進，便自平板培養基上刮取菌體，直接進行萃取脂肪酸，較早的萃取方法如圖一所示。

圖1 細菌細胞脂肪酸萃取步驟。

商業化的分析工具

Microbial IDentification Inc (MIDI) 成立於1991年，該公司開發了一套以細菌脂肪酸為鑑定依據的系統，依據其標準作業程序，收集並萃取出細胞脂肪酸，置入全自動化的GLC中，透過其資料庫比對分析，即可快速比對出未知分離株的近似種類；若是進行新菌種的脂肪酸組成分析，該系統亦會提供詳細的資料給使用者。

 

圖2. MIDI所提供的脂肪酸標準化步驟。(詳細可至該公司網站下載資料。)

 

後記：

早在二十多年前，台灣已經引進此系統，畢竟它的價格並不是一般的實驗室可以負擔，因此，食品工業發展研究所( FIRDI: Food Industry Research and Development Institute)轄下生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center)提供商業化的代工服務，如果有需要可逕洽該單位。

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台灣海洋細菌的研究 (7) 細菌鑑定之脂肪酸分析(一)

細胞脂肪酸與分類學

傳統細菌分類法，不外以細菌形態、生理與生化及生態等特徵加以分類。但隨著知識和技術的快速累積，細菌學者注意到不同類別的細菌，其細胞內分子階層各物質(如核酸、脂質、蛋白質等)之異同，而有遺傳分析(genetic analysis)，血清學(serology)，化學分類(chemotaxonomy)等方法為學界所應用，使細菌分類之客觀性大幅提昇。

細胞脂肪酸的組成分析係化學分類法之重要項目之一，它在細菌鑑定及辨種上非常有用，有報告指出利用脂肪酸之組成分來歸類菌種，其效果與利用核酸雜交方法來歸類相似(Costas et al. 1992)，不論是常溫細菌(Bertone et al. 1996; Veys et al. 1989)或好熱性細菌(Danato et al. 1990; Tindal 1991)，都可利用此方法進行明確及快速鑑定。由於分析技術改良，及商業自動化流程的建立，由抽取全細胞脂肪酸到完成分析，僅耗費很短時間(Moss 1990)，因此它已成為細菌鑑種的必要項目。

脂肪酸與細胞膜之關係

細胞膜是細菌管制營養及代謝廢物進出細胞之門徑，並身兼感應外部訊息之工作，以傳遞訊息使細胞對環境之壓力(stress)有所回應，做出適當之調適。細胞膜之流動性影響許多發生在膜上的重要生化反應，而脂質是決定膜流動性之關鍵角色，其中脂質之脂醯基鏈( fatty acyl chain)之形態、固醇(sterol)量多寡、磷酸脂親水性頭端(polar head-groups of phospholipids)的性質等因子均與膜流動性的維持有密切關係(Russell 1989)，此三者中，以脂醯基鏈(即是脂肪酸)之型態於決定細胞膜脂質的物化特性上扮演特別重要的角色。

影響細菌細胞脂肪酸組成變化的因子

1.  溫度

溫度是影響細菌生存的重要因子，許多細菌可藉由溫度適應機制(thermo-adaptation mechanism)調整細胞內部功能及改變成分，諸如：製造溫度誘發蛋白質(temperature-induced protein)(Wu and Welker 1991; Trent et al. 1994)、改變營養需求(Campbell and Williams 1953)等，使細菌能順利度過不適宜的環境。而細菌為因應溫度變化，亦會改變細胞膜上脂肪酸組成比例，藉此維持膜的流動性及功能，已有證據顯示脂肪酸之改變影響到細胞膜上酵素之調控(Brenner 1984)，而細胞膜之脂質種類變化亦被認為是生物生存在高溫的重要憑藉(Ratledge and Boulton 1985)。一般而言，微生物傾向於環境溫度升高時增加細胞膜上飽和及長鏈脂肪酸之比例，在溫度降低時不飽和及支鏈狀(特別是anteiso)比例增加，亦即藉著細胞膜熔點改變，使其流動性得以適度的調節(Cronan and Gelmann 1975; Hasegawa et al.1980; Russell 1983; Suutari & Laakso, 1992)。

2.  鹽度 (NaCl)

大部分能生存於高滲透壓環境之生物，將低分子量的物質聚集在內部以平衡細胞膜所受到之滲透壓(Yancey et al. 1982)，其中利用有機物調整細胞內部膨壓的報告已散見於有關細菌、藍綠菌、真菌、藻類及酵母等之研究上(Ben-Amotz and Avron 1983; Csonka 1989; Hagemann et al. 1987; Hocking 1986; Meikle et al. 1988)。抵抗滲透壓最直接之方式是改變細胞膜上脂質之組成，在許多耐鹽及好鹽性細菌細胞，由NaCl誘發細胞膜脂質組成改變，使細菌在高滲透壓環境中得以控制離子之穿透力，得以維持細胞之完整性(Hiramatsu et al. 1980)，而改變膜上脂質之最佳方式則為轉換其脂醯基鏈(脂肪酸)之種類(Russel and Kogut 1985)。細胞脂肪酸組成因培養基之NaCl之濃度改變而產生變化者發生在許多耐鹽性及好鹽性細菌(Hanna et al. 1984; Monteoliva-Sanchez et al. 1987)。

3.  培養基

常溫細菌細胞膜脂肪酸之種類組成和比例易隨各種培養條件而發生變化(Adams & Russell, 1992; Suutari & Laakso, 1992)。

4.  增殖期(growth phase)

細菌在不同增殖期時，其細胞脂肪酸組成會有不同程度之變化(Nordstrom 1992; Ratledge and Boulton 1985)。

脂肪酸分析技術

取在最適培養條件下剛達穩定期之菌液，離心後，將菌體凍乾，然後以多種有機溶劑萃取出細菌細胞膜上之脂肪酸。萃取方法主要依據Suutari et al. (1990)及Moss (1990)的方法再略加修改，其詳細步驟如流程圖所示。獲得之脂肪酸衍生物萃取液則以氣相層析儀(Gas Chromatography, GC)分析脂肪酸之種類組成及比例，其儀器配備及分析條件如下：

儀器配備

氣相層析儀： Shimadzu GC-14A

積分儀： Chromatopac C-R6A

管柱： fused silica capillary BP-70 column (SGE, 25 m×0.25 mm i.d., 0.25 mm film thickness)

分析條件

攜帶氣體：He (流速為4 ml/min)。

注射口：100℃。

火焰-離子偵測器(Flame-Ion Detector)：250℃。

管柱溫度：100℃維持1分鐘，再以每分鐘昇高 5℃ 之速率加溫至220℃，於220℃下維持8分鐘。

(待續.....)

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台灣海洋細菌的研究 (6) 海洋細菌分類學(Taxonomy)

必也正名乎

小子曰：「小子待師而實驗，師將奚先？」

師 曰：「必也正名乎！」

小子曰：「有是哉，師之迂也！奚其正？」

師 曰：「野哉小子也！吾等於其所不知，蓋闕如也。名不正，則言不順；言不順，則事不成；事不成，則Paper不登；Paper不登，則計畫不過；計畫不過，則吾等無所措手足。故細菌名之必可言也，言之必可行也。吾等於其言，無所苟而已矣。」

這是微生物分類實驗室的寫照，替未知微生物分類與命名(或正名)，關係到實驗室的存活，paper 發不去，計畫當然爭取不到，實驗室接著關閉，老師也就喝西北風去了！但是細菌的正名工作容易嗎？其實它的前置準備工作是很累人的。

これは何ですか？

 大多數人對於沒見過的生物，會提出 “這是什麼？” 的疑問，接著會繼續追問：

   能吃嗎？ (有毒否？)

   好吃嗎？

   有什麼功用？

   從那兒來的？

   怎麼生存？

   如何培養、繁殖？……

以上是看似簡單的問題，若想要精確地回答，則必須要對此物種的形態、生理、生化機能、遺傳和生態等有一定程度的瞭解，才能提出令人滿意的答案，而上述這些知識和技能都包括在分類學(taxonomy)的範疇內。

分類學是一門解答人們對於物種疑惑的科學，簡而言之，其目的是告訴您：”它是什麼東西！”(正名)。分類學主要根據個別物種的特性 (characteristic,或稱特徵)，把相近者予以歸類在同一分群中，反之透過了解分類群的某一成員的特徵，可以假設同一群體的其他成員亦可能具有相似的特徵。基於上述的原則，自環境中取得任何未知的生物樣本，學者必須藉由特性的比對，判斷樣本為何物種或近似何物種，進而瞭解它是否有開發或利用的價值。

一般而言，大型生物多以外觀(表型, phenotype)特徵即可達到初步鑑定種類(鑑種)和分類的目的，然而肉眼無法辨識的微生物，其鑑種工作著實相當繁雜。以細菌而言，不管是形成清晰可見的菌落或是在顯微鏡下的細胞，其樣態並無太大的變化，從事微生物的工作者必須利用許多工具和方法，將它們的特性表列出來，再加以分門別類，達到鑑種的目的。譬如：人體受到細菌感染，醫生必先採取病人樣本，進行細菌培養與快速鑑定，如此才能正確用藥，達到治療的目標，如果盲目地用藥，不僅病人無法康復，亦可能會造成其它不良的副作用。

細菌分類學(Taxonomy)內涵

 1968年Cowan對細菌的分類學做了相當好的解釋，他認為Taxonomy包含三個項目：

  1. 分類(Classification)：對分類單元進行順序的安排，編進較大的群組。

  2. 命名(Nomenclature)：對被確定的分類單元貼標籤，也就是給予命名。

  3. 鑑定(Identification)：將未知物種與已知分類種進行特性(特徵)比對，確定後予以貼標籤(給予種名或屬名)。

  基本上，鑑定是分類和命名的實際應用，而這三項目建構成分類學。但隨著生命科學的進步，有許多學者認為除了上述三個項目外，應該還需加上演化及系統發生的要件，對細菌分類學才會有比較完整的論述，因而提出系統分類學(Systematics)的概念。但也有人認為分類學與系統分類學所代表的詞意是相同的。

Taxonomy包含Characterization、Identification和Classification三個項目。Characterization為分類學的前置作業，它包含所有檢測細菌特性的調查和實驗工作。

特性檢測(Characterization)

由上圖可以看出，分類學多屬資料分析比對的工作，相較於在它之前特性檢測，後者顯然才是繁重和複雜的實作項目，它主要把細菌細胞從裏到外，任何可以表現出它與眾不同的特點找出來，資料俱足後，才進入分類學領域，與已知菌種進行比對分析，達到分類鑑定的目的。細菌的特性大致上可以分成幾個項目：

1.Morphological characteristics

2.Chemical composition

3.Cultural characteristics

4.Metabolic characteristics

5.Antigenic characteristics

6.Genetic characteristics

7.Pathogenicity

8.Ecological characteristics

海洋細菌之特性檢測(Characterization)實作項目

1. 細胞和菌落形態觀察

(1)菌落的諸類形態學觀察(肉眼，解剖顯微鏡檢)；分離株細胞的相位差和電子顯微鏡觀察。

(2)實測項目包括：菌落外型、色素產生、擴散性（swarming）、革蘭氏反應（Gram reaction），細胞切片等。

2. 細菌分離株生長特性之檢測

(1)分離株對於鈉離子需求性、pH、溫度、醣醇類的利用性、氧氣需求性。

(2)實測項目包括：單一碳源測試（L-阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露 糖、蔗糖、木糖。甘露醇、肌醇、檸檬酸、延胡索酸、乳酸）、醣類發酵測試（測試碳源與單一碳源測試相同）

3. 分離株之生理、生化特性之檢測

(1)各類檢測方法可以參照Shieh et al (1998)、Gerhardt et al. (1994)、Kelly et al. (1991)或Smibert & Krieg (1994)等論述。

(2)實測項目包括：觸酶（catalase）、氧化酶（oxidase）、 洋菜水解酶（agarase）、澱粉酶（amylase）、去氧核糖核酸酶（DNase）、 七葉靈酶（esculinase）、明膠酶（gelatinase）、解脂酶（lipase）、蛋白酶（protease）、精胺酸雙水解酶（L-arginine  dihydrolase）、賴胺酸去羧酶（L-lysine decarboxylase）、鳥胺酸去羧酶（L-ornithine decarboxylase）、脫 氮反應測試、吲朵（indole）生成、硫化氫（H₂S）生成、硝酸還原測試。

4.分離株化學分類檢測：

(1)G + C含量：

(2)細胞脂肪酸組成：

(3)細胞膜醌組成：

(4)Polar lipid：

5. 親緣分析

(1)16S rRNA基因(16S rDNA)定序與分析。

(2)16S rDNA之RFLP分析。

簡易海洋細菌分類、鑑定流程圖。

後記：

《論語•子路第十三》子路問孔老夫子曰：「衛君待子而為政，子將奚先？」，孔子曰：「必也正名乎！」，末學將此篇改了一些，實有違先人聖訓之要旨，在此先行自懺一番。惟微生物的鑑定和命名著實相當艱辛的工作，每一個檢測項目都要花很多時間和金錢，聚集相當資料後，才能判斷”它是誰！”，之後，才能決定捨棄或進一步研究。誠如日片”君の名は”，當你忘了對方的名，要在茫茫人海中再度相遇，何其困難，倘若知道了名字，呵…用古歌大神或許就沒問題了！

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