台灣海洋細菌的研究 (5) 海洋細菌培養基 (Culture Media)

養菌之題外

嬰仔嬰嬰睏一暝大一吋

嬰仔嬰嬰惜一暝大一尺

搖囝日落山抱囝金金看

你是我心肝驚你受風寒……

(摘自：搖嬰仔歌；作詞：蕭安居/廬雲生作曲：呂泉生)

這是一首給母親唱的歌，每次末學把接種完成的培養皿或試管置入培養箱時，心中大多會浮現此歌的旋律。養菌跟養小孩一樣，要提供它最好的食物和最好的生活環境，而且還要時刻照料，希望它們能夠平平安安、快快長大，為主子爭光去。

細菌的營養型態

地球上的生物都需要攝取營養來維持其生命與生長，動物需要蛋白質、醣類、脂肪、維生素和礦物質等；植物所需要素以氮、磷、鉀為主；細菌則是一群特殊的生命，因為各自的營養型態不一樣，所以需要的養分差異很大。因此，針對不同的菌種，把必要的成分調製在培養基中，這樣才能提供這些小生命完整的營養。學者依營養(獲得能量)型態，將細菌分為幾個類別如圖所示：

對症下藥

看完上圖所分類的細菌營養型後，怎樣針對目標菌種，調配出適合的培養基，可能仍是一頭霧水。還好，許多專家已經把各類型的培養基成分公告在各種不同的專業期刊上，您只要細心的去找，一定能夠尋獲適合的培養基配方。譬如：培養海洋異營性細菌最著名的培養基為Marine Broth 2216 (Marine Agar 2216)，此培養基的配方係仿照海水的成分，把一些看似微量成分都加進來，其主要目的是想把大部分的異營性細菌都培養出來 (但是事與願違，容後再述)。

Marine Broth 2216

Yeast Extract	1.0 g
Peptone	5.0 g
Ferric Citrate	0.1 g
Sodium Chloride	19.45 g
Magnesium Chloride	5.9 g
Magnesium Sulfate	3.24 g
Calcium Chloride	1.8 g
Potassium Chloride	0.55 g
Sodium Bicarbonate	0.16 g
Potassium Bromide	0.08 g
Strontium Chloride	34.0 mg
Boric Acid	22.0 mg
Sodium Silicate	4.0 mg
Sodium Fluoride	2.4 mg
Ammonium Nitrate	1.6 mg
Disodium Phosphate	8.0 mg
H2O	1 Liter
Agar*	15.0 g

*, only for Marine Agar 2216.

仔細察看Marine Broth 2216的成分，NaCl的量僅有19.45 g，遠低於海水實際的鹽度。為什麼會這樣？不是要仿照海水的成分嗎？其實大多海洋細菌最喜歡的鹽度並不是3.5 %，而是2.0-2.5 %左右，而且Marine 2216的成分中含有高量的二價Mg²⁺ 和Ca²⁺，根據許多研究指出，這兩種離子可以取代Na⁺。因此，將這些成分加成後，也就符合考慮培養基配製的邏輯了。

再舉一個例子，如下表NS-I medium，分析其成分，NaCl計有20g，應是海洋細菌的培養基；碳源僅為glucose，表示它是一種簡單培養基(或稱為單一碳源培養基)；氮源部分，僅有NH₄Cl，並無蛋白質成分提供氮源，但若把NH₄Cl改為yeast extract (YE, 酵母萃取物)，它就變成是一種複合培養基了，因為YE含有整個酵母成分，包含蛋白質、醣類 (碳源)、微量元素和其它營養成分。

NS-I medium

(a)
NH4Cl*	10mg
NaCl	20 g
MgSO4.7H2O	0.5 g
CaCl2	10 mg
FeCl3.6H2O	5m g
MOPSO (Sigma)	4.5 g (20 mmol)
Deionized water	850 ml
pH  7.0
(b)
K2HPO4	0.2 g
Deionized water	50 ml
(c)
Glucose	5 g
Deionized water	100 ml

* NS-II medium：將NS-I medium中之NH4Cl以
yeast extract (20 mg)取代。

末學最常用的異營性細菌培基為Polypepton-yeast broth (PY broth)，其成分簡單 (如下表)，容易配製，而且符合標的菌種的需求。

Polypepton-yeast broth (PY broth)

Polypepton (Daigo, Tokyo)	2.0 g
Bacto-yeast extract (Difco)	0.5g
NaCl	20.0 g
MgCl2.6H2O	5.0 g
Agar*	15.0 g
Agar**	5.0 g
Distilled water	1000 ml
pH	7.0

**, only for PY stab.   *, only for PY-agar plate.

培養實作

海洋細菌培養實作過程，首先要先把樣本取回 (採樣)，再進行實驗室內的處理，其摘要如下：

(1) 培養基

本研究所採用之培養基共計二種：1 PY平板培養基用於異營性細菌計數及增菌培養；2 PYG 平板培養基則用於海洋弧菌計數及增菌培養

(2) 採樣和細菌計數

本研究在港區(如人工潮池、人工沙灘及突提等工程)，分設數個測站，在這些測站採集底泥樣本後，於低溫下迅速帶回實驗室，利用NaCl-Tris緩衝液（1.5% NaCl+10mM Tris, pH 8.0），將水樣以10的倍率多個階段稀釋。並儘速進行以下處理：

A.平板計數

(A)異營性細菌生菌數

取各樣品之原液和不同倍率稀釋水各0.1 mL，依序塗抺於PY平板培養基上，再置入30℃ (培養時間及溫度可再考量)培養箱中，在好氣條件下培養一星期後，觀察並記錄 PY 培養基上之菌落總數。

(B)海洋弧菌生菌數

承上述(A)法，將PY培養基改為PYG培養基，並改以嫌氣條件（利用anaerobic jar）培養三日後，觀察並記錄培養基上之菌落總數。

B. MPN 計數

(A)異營性細菌

a.取各樣品之原液和不同倍率稀釋水各1 ml（稀釋水取稀釋10¹-10⁵倍者），分別接種於PY液體培養基中。

b.接種後之PY液體培養基之培養系列分別置於好氣條件下培養15-18小時。培養溫度設定為30℃。

c.觀察培養液生長之有無（即液體培養基是否呈現明顯混濁）根據培養管系列混濁的數目及分布情形，查表即可估得各水樣品中異營性細菌的最大可能菌數(Most Probable Number, 簡稱MPN)。

(B)海洋弧菌計數

仿異營性細菌計數法，僅將培養基改為PYG，而培養條件改為嫌氣培養。

 (3) 菌株之分離與保存

於上項2之PY及PYG 平板培養基中挑選形態相異之菌落，用連續劃線法加以純化，確認為純菌後，接種於PY高層培養基中，並置於20℃恆溫箱中行繼代保存；繼代保存每三～四個月進行一次。

培養基的設計非常重要，關係到實驗的成果，而且由培養基的成分，也約略可看出菌種的特性。有志於微生物領域的學子，應該要好好學習這門功課。

  培德積功心牢記

  養性修心身力行

  基穩礎固道不離

  成敗是非意勿執

  分秒須臾念轉空

  明經暗意理自解

  奧理妙學靈可通
  義盡仁至功大成

後記：

當年實驗室比較窮，一瓶Marine 2216 (500 g)要價台幣4,500塊，以末學的認真度，大概幾次實驗就用光了，因此只得自己配置，光看到那個配方，就頭大，而且每次用的量都不一樣，得重新計算過。後來，終於有比較佛心的廠商出產價格比較低廉產品，這才解決困擾。

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台灣海洋細菌的研究之番外篇(3). 為菌嚐藥

題外

人可以粗略分為兩種，一種没有自信，另外一種是有自信(就如柯P常講：一種是有插管，另一種是没有插管的)，當然這兩類人是可以再細分，譬如有自信的人在程度上會有自信滿滿，有點自信等等的區分   (但插管的就不能分成全插或半插囉)。自信滿滿的人，有時候會變成呼六 (唬爛) 的人，他們常常會把話說滿了，但真正操作的時候，卻又胡亂瞎搞。在此呼籲，没有自信的人絕對不要進實驗室！

玻璃，心易碎

 話說，進微生物實驗室，第一要先摸清洗試管的奧義   (此處再強調一次)；第二步學會配培養基(以下簡稱：配藥)。第三接種菌株；第四…

配藥的工作，說難不難，只要照著配方走，好比煮菜一般，醬油一茶匙，鹽一小匙，糖一大匙……最後再試鹹淡口味，是否符合味覺的極佳感受。雖然這樣比喻，兩者之間還是有一些差別 (譬如：炒菜的 "火候"   很重要，配方雖對，但火候不對，就GG了)。按照培養基配方，把全部材料加入到水中溶解，最後一個步驟是調整pH (酸鹼)值 (如同試鹹淡口味)，只是這步驟必須得用酸鹼檢測計 ( pH meter ) 來探知，並用酸液或鹼液調整pH，直到符合配方的要求。

pH meter 的探針是玻璃製成的，剛進實驗室時，學長就交待要好好對待它，因為不小心，它就會跟你拜別 (當時價格NT$ 1,600，唉…〝玻璃讓心碎〞)。為了要避免不必要的困擾，每次使用它時，便會戰戰競競，但意外難免發生。在末學還是菜鳥時的幾個月內，大概壓破兩支，變成老鳥後，竟也失手又弄壞一支。根據私人統計，pH meter損壞率是一定的(與夾娃娃機的概念一樣)，由此可見，pH meter損壞常會被認真配藥的研究生給碰到 (讚嘆一下自己)。

圖左那根有黃色接頭玻璃管，就是pH meter的探針。
(懶得P圖，說真的貼上這張照片，會讓人覺得這間實驗室管理欠妥！)

為菌嚐藥

某一日，進實驗室，甲學弟告知pH meter探針頭又掛了，無法配藥，已訂了新貨，但要幾天才到，只見他收拾包袱，飄然而去。此時，瞥見實驗臺前有一位乙學弟正在配製藥品，只覺他自信滿滿令人震懾 (當年不知，現才懂得 "人到一種境界，會散發出某些能量"  ，今人難以招架)，只見他興起緩緩拾起藥匙，舀了一瓢培養液，送入口中，發出嘖..嘖..嘖的聲音，接著喊了一聲   "delicious"，放下藥匙，配製完成。當下，年輕的末學頗為驚嚇，世上竟有如此性情中人！

做過科學研究的人都知道，在試驗過程中，若有一個步驟出差錯，可能整個試驗都得重來，生命科學的試驗也一樣，非常注重再現性！培養基pH值關係到細菌的存活與增殖，所以配製培養基的SOP是師兄弟間必須傳遞和遵守的規則，這才能保證養得出細菌來。為何這專業學子，會做出這樣的事來？這疑問在末學心中縈繞許久，隨著經驗的累積終究還是解開了！

為什麼？其實，實驗室所指定的培養基成分(藥品)都是固定的，劑量也固定，品牌也固定，那麼溶入水中後，其pH值大概不會變動太大，最多就差個0.1左右了，要調整至正確值，用的酸鹼液量也就固定了，所以這個專業且自信滿滿的學弟，當年的確悟到這個原則，因此在滴入數滴鹼液後，大膽以口試藥，也表明〝人既可食，菌亦可食〞的深奧道理。至今，末學仍佩服不已。有詩讚曰：

古黔婁嘗糞憂親

今學子試藥養菌

天然混成兩難比

才子牽掛只為伊

有人會問：pH值差0.1會不會影響細菌的生長？

末學不負責任並大膽地告訴諸位，百分百會影響，但這個差別您肉眼一定看不出來，用儀器測量也在95%的信赖區間內 (這樣到底有没有影響？)。因為，除了pH值外，實際操作過程中，還有許多因素參雜其中，造成每次培養出現一些差異。