顯示具有 分離菌株 標籤的文章。 顯示所有文章
顯示具有 分離菌株 標籤的文章。 顯示所有文章

台灣海洋細菌的研究 (4) 海洋細菌怎樣培養? How to cultivate marine bacteria?

三千弱水,只要一瓢!

「寶玉呆了半晌,忽然大笑道:『任憑弱水三千,我只取一瓢飲。』」
  林黛玉:表示……
  薛寶釵……

這是曹雪芹在紅樓夢中,描述賈寶玉只愛唯一的情節。的專情並不是本文所關注的重點,一瓢弱水的生命內涵是什麼?才是微生物工作者想要知道的。

細菌培養

我們都知道這一瓢海水裏有細菌,但人的肉眼看不到,如何把它們從海水中挑出來,進行培養?一般而言,細菌的培養包含幾個工作:

  1. 培養基製作:預先擬定研究的目標菌種,根據菌種特性設計培養基。  
  2. 分離菌株:利用培養基,將細菌從環境(海水、底泥、鹽沼等)中分離()出來。這個把細菌挑出來培養的過程,學界術語稱作:分離(isolating)
  3. 純化培養:確認所分離之菌株為純系,才會進一步執行相關的試驗。       

分離菌株的最簡單方法一般會用平版培養基,讓細菌在上面生長成一顆顆菌落
(
基本上一隻細菌會進行細胞分裂,最後聚集成為一個肉眼可以見到的菌落)

分離菌株實際操作方法與步驟如下:

  1. 準備培養基:包括(緩衝)稀釋液和平板(洋菜)培養基。
  2. 採樣:到海邊去,取一瓢(桶、瓶、罐、壺等等等都可以)海水回來。
  3. 利用(緩衝)稀釋液,將水以10的倍率多個階段稀釋。(為什麼要稀釋10…..1000.)
  4. 將不同倍率稀釋後的海水,各取約0.1 mL,均勻塗抹於平板培養基上,放置於25~30度的恆溫箱中培養。
  5. 培養數日後,平板培養基上會出現大大小小不同形態和顏色的菌落,挑選您合意的菌落,用連續劃線法加以純化,確認為純菌後,接種於高層培養基中,並置於20℃恆溫箱中行繼代保存;繼代保存每三~四個月進行一次。

您如果想要在茫茫大海中,找到那一個唯一最愛的菌種,除了運氣外,培養基的設計將會大大提升成功的機會。(至於怎設計?待咱另回分解!)

   
題外:弱水在那兒?
海內十洲記記載:鳳麟洲在西海之中央,地方一千五百里。洲四面有弱水繞之,鴻毛不浮,不可越也。洲上多鳳麟,數萬各為群。又有山川池澤,及神藥百種,亦多仙家。

山海經大荒西經:西海之南,流沙之濱,赤水之後,黑水之前,有大山,名曰崑崙之丘。有神,人面虎身,有文有尾,皆白,處之。其下有弱水之淵環之,其外有炎火之山,投物輒然。有人戴勝,虎齒,有豹尾,穴處,名曰西王母。此山萬物盡有。

閱畢古人對〝弱水〞神話般的敍述,末學覺得何不把台灣周邊海域統稱為弱水呢?雖然比喻好像有點不倫不類,但是想要從台灣轄內浩的海水培養出細菌,也只能如賈寶玉一般,三千弱水只取一瓢,然後運回實驗室好好瞭解了!


Alterococcus agarolyticus 做引子, 談談台灣海洋細菌的研究. (1)

寫在之前....

台灣海洋細菌的分類研究,相較於歐、美、日等先進國家是發展較晚的。公元1989年二月,末學恩師台大海洋研究所謝文陽教授自日本返國任教,才算是正式開啟台灣的相關研究。草創時期總是較艱辛的,不外是經費和分析工具的不足,這也是新穎菌種發表功虧一簣的主要原因。公元1998年,由末學與教授正式在期刊發表了台灣第一株代表新屬、新種的海洋細菌 Alterococcus agarolyticus,才算正式搭上了細菌分類的列車。公元2000年後,海洋細菌的研究跨入百家爭鳴的階段,也引發許多新國家的興趣,亞洲的中國與南韓有多組團隊投入這個領域,當然也成為我們的競爭的對手 (Why?此容我暫略)。這十多年來打了一場美好的戰役,實驗室發表了九個新屬的菌種,但隨著教授今年榮退,這數字相信再也不會增加了,這亦是末學想提筆記錄的原因之一。

 Alterococcus agarolyticus  從那來的?

一九八O年代起,深海熱泉的菌種相繼被發現,這個主題儼然成為當時細菌界的顯學。台灣有没有能力做?没!没!没!....没工具、没經費、没經驗....那....有没有替代方案?  啊....台灣有個綠島海濱鹹水溫泉(世界唯三),剛好略沾上邊(當時龜山島地熱噴孔還没人理它!這個以後再來談!)。我們家老大(謝教授)洞察此情,就帶著鋼盔衝了,也就順理成了末學的研究重心了....




西元1996年的溫泉區全景



當年的帥哥研究生在採樣(頭上那一頂是俊國熊,但當時是象迷哦!)

樣本取回後開始培養 (要培養來自溫泉的高溫菌當然要有一些秘技!),發現會分解洋菜膠的菌株,這引起了末學極大興趣,於是將它純化分離,進一步要拆解它的一些生理、生化功能。
經染色的洋菜膠培基,菌落位於透明凹陷處。

電顯照 (它很難染色,這是比較好的照片!)
該做的都做了!......就差16S rRNA基因定序!但没人做過!?
誰來教?   感謝台大BBS生物版的隠士,指引了明路,完成定序,並把系統樹畫好...


Alterococcus agarolyticus  在演化上是極為特殊的一個分枝

下一步就是投稿!等待的日子總是難熬地....但難題又出現了!
回函:請做切片,做為判斷是革蘭氏陰性或陽性的證據。啊....我們不是染色了嗎?  
Reviewer認為:球菌大多是陽性,請切片證明!  {哇哩咧...誰規定球菌一定是陽性。  海洋細菌(好鹽的哦)幾乎都是陰性啦!切片誰會啊.....?}
還好,朋友不少,就生出了照片....


陰性菌的細胞壁 (紀念友人湯致遠)


光學顯微鏡下的球菌
總結:
Alterococcus agarolyticus

  • Verrucomicrobia
  • Gram-negative Cocci
  • Motile
  • Facultatively anaerobic
  • Slightly Thermophilic  (38-58°C, optimum 48°C)
  • Slightly Halophilic (1-3% NaCl )
  • Agarolytic
  • CJM  1998




遺珠之憾! (具有脫氮能力的高溫細菌,達65度以上,但未能發表....)
西元1988年CJM刊出了此菌,也成為台灣第一株正式學術發表新屬新種的海洋細菌。但...緊接著末學也去數饅頭了!(待續..)


{本文同步刊登於痞客邦}

科學農業 -- 智慧型灌溉 (台南官田區)

台灣的降雨時間分配顯著不均,豐枯季分明,使得水資源調配不易。依目前氣候變遷之情勢觀察,近十餘年有年平均降雨量呈現旱、澇加劇及頻 繁 的現象,且不確定性增高,影響農業灌溉用水之營運甚鉅。 台灣農業用水包括灌溉、養殖及畜牧等三項。早期之農業用水係以水稻灌溉為主,惟 ...