台灣海洋細菌的研究 (4) 海洋細菌怎樣培養? How to cultivate marine bacteria?

三千弱水,只要一瓢!

「寶玉呆了半晌,忽然大笑道:『任憑弱水三千,我只取一瓢飲。』」
  林黛玉:表示……
  薛寶釵……

這是曹雪芹在紅樓夢中,描述賈寶玉只愛唯一的情節。的專情並不是本文所關注的重點,一瓢弱水的生命內涵是什麼?才是微生物工作者想要知道的。

細菌培養

我們都知道這一瓢海水裏有細菌,但人的肉眼看不到,如何把它們從海水中挑出來,進行培養?一般而言,細菌的培養包含幾個工作:

  1. 培養基製作:預先擬定研究的目標菌種,根據菌種特性設計培養基。  
  2. 分離菌株:利用培養基,將細菌從環境(海水、底泥、鹽沼等)中分離()出來。這個把細菌挑出來培養的過程,學界術語稱作:分離(isolating)
  3. 純化培養:確認所分離之菌株為純系,才會進一步執行相關的試驗。       

分離菌株的最簡單方法一般會用平版培養基,讓細菌在上面生長成一顆顆菌落
(
基本上一隻細菌會進行細胞分裂,最後聚集成為一個肉眼可以見到的菌落)

分離菌株實際操作方法與步驟如下:

  1. 準備培養基:包括(緩衝)稀釋液和平板(洋菜)培養基。
  2. 採樣:到海邊去,取一瓢(桶、瓶、罐、壺等等等都可以)海水回來。
  3. 利用(緩衝)稀釋液,將水以10的倍率多個階段稀釋。(為什麼要稀釋10…..1000.)
  4. 將不同倍率稀釋後的海水,各取約0.1 mL,均勻塗抹於平板培養基上,放置於25~30度的恆溫箱中培養。
  5. 培養數日後,平板培養基上會出現大大小小不同形態和顏色的菌落,挑選您合意的菌落,用連續劃線法加以純化,確認為純菌後,接種於高層培養基中,並置於20℃恆溫箱中行繼代保存;繼代保存每三~四個月進行一次。

您如果想要在茫茫大海中,找到那一個唯一最愛的菌種,除了運氣外,培養基的設計將會大大提升成功的機會。(至於怎設計?待咱另回分解!)

   
題外:弱水在那兒?
海內十洲記記載:鳳麟洲在西海之中央,地方一千五百里。洲四面有弱水繞之,鴻毛不浮,不可越也。洲上多鳳麟,數萬各為群。又有山川池澤,及神藥百種,亦多仙家。

山海經大荒西經:西海之南,流沙之濱,赤水之後,黑水之前,有大山,名曰崑崙之丘。有神,人面虎身,有文有尾,皆白,處之。其下有弱水之淵環之,其外有炎火之山,投物輒然。有人戴勝,虎齒,有豹尾,穴處,名曰西王母。此山萬物盡有。

閱畢古人對〝弱水〞神話般的敍述,末學覺得何不把台灣周邊海域統稱為弱水呢?雖然比喻好像有點不倫不類,但是想要從台灣轄內浩的海水培養出細菌,也只能如賈寶玉一般,三千弱水只取一瓢,然後運回實驗室好好瞭解了!


台灣海洋細菌的研究 (3) 海洋細菌(Marine Bacteria)怎麼說?



您哪位?(Who are you?)


台灣人是誰?誰才是台灣人?這個命題對於許多人而言,是困難回答的,因為它涉及到錯綜複雜的歷史和個人的情感問題。以法律論,大概可以擁有國籍者稱之,但這金、馬兩地又GG了?所以,請各自表述。

為什麼講海洋細菌,會談到這個敏感問題?因為末學覺得它們的爭議很相似!

無所不在的細菌


細菌是群特殊的生命,它們在天、地、水三界中無所不在,只要環境因子適合,即可任意而行,恣意而生。與其它生物一樣,"空中" 大多是它們短暫經過的地方,終將墜落於陸地或水界。尤其水界又分為陰陽 [ ()、淡]兩個分界 (這邊順提一下,大部分學者會把淡水域包含在陸域內,之後末學也會把來自此的細菌統稱為陸源細菌),這兩個絕對不一樣的地方,海水含有約3.7%的鈉鹽,淡水鈉鹽含量則完全讓人感覺不到它的存在。這個鈉鹽的因素,成為侷限了不同細菌種類的分布的原因之一,也是許多學者認定是否為海洋細菌參考的準則 (也是爭議的所在)

在大多數的地方,能查到海洋微生物的定義大概都是如下寫法:
Marine microorganisms are defined by their habitat as the microorganisms living in a marine environment, that is, in the saltwater of a sea or ocean or the brackish water of a coastal estuary.

没錯!多以棲地做為區分的原則。同理可推,海洋細菌就是生存在海水域的細菌。但是對於細菌這種單細胞生物來說,"生存"這個詞也隱含著"不死"意涵。為什麼如此解釋?在這裏需要闡明,相對於多細胞生物,細菌真的簡單多了,當環境變成嚴苛時,有些種類會死亡,但也有許多種類可以把細胞的代謝降到最低,甚至幾乎停滯的狀態(也就是不死,龜息大法也!),來渡過這個階段。

陸源細菌會隨著降水、河川水等等,流入海洋,雖然海洋對於它們來說是嚴苛的環境,但許多陸源性細菌仍可以存在(不死)於海洋中,有些甚至可以不畏鈉鹽,在海水中繁殖(定居下來囉!)

問題來了,您到海邊取一瓢海水,裏面存在的都是海洋細菌嗎?

 海洋細菌 (marine bacteria)

 下面是比較嚴謹的定義:

海洋細菌泛指能夠在海洋環境中"生存""繁殖"之細菌,包括好鹽性(halophilic)和非好鹽性(non-halophilic)兩大類族群,其中只有前者是以海洋為原棲地,可謂是真正的海洋原生種細菌
  1.  定義中出現"繁殖" (Growth, 末學比較喜歡用"增殖")這個概念非常重要,因為生命的意義是在創造宇宙繼起之生命 (講白話一點就是繁衍下一代),所以要成為海洋細菌,一定要能夠在這兒落地生根。
  2. 好鹽性細菌:有鈉鹽需求者,没有鈉鹽,代謝會出現問題,無法繁殖。
  3. 非好鹽性細菌:没有鈉鹽需求者,有此菌種可能因某些原因,變成不需鈉鹽,另外有些種類是陸源性菌種至此定居者,但它們在海水中都可以繁殖。


海洋細菌定義的爭論點:
  1. 統合納海派:來自(存在)海水的細菌,皆是海洋細菌。
  2. 基本教義派:有鈉鹽需求者,也就是來自海洋的好鹽性細菌才算。
  3. 邏輯學理派:就是本文所提,咱老大下的這個定義啦。
所以,您喜歡那一派?您取的那瓢海水,就各自表述了。

 海洋細菌中最著名的一群:Vibrio

 弧菌屬(Vibrio)之菌種為海洋環境中最重要的細菌群之一,約佔河口或沿岸水域中可培養異營細菌總生菌數之10-50 % (Blake et al., 1980).。它們均屬於革蘭氏陰性桿菌,在23NaCl濃度下有最佳生長(Borrego et al., 1996)Simidu & Tsukamoto1985)指出,各種海洋弧菌在海水中的分布,大多不受地理區域的限制,但卻有依深度而分棲(habitat segregation)之傾向。它們與許多海洋生物有密不可分之關係,形成寄生、共生或其他類型之共存型式(Shieh et al., 2003),其中有些種類更是人類和多種海洋動物之致病菌,諸如瘡傷弧菌(Vibrio vulnificus)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus,或稱副溶血弧菌)等深具感染力,可透過食用海產及各種親水活動成為腸道病原菌(Blake et al., 1980Borrego et al., 1996Haldy et al., 1996Ishimaru et al., 1996Lee et al., 2002)

讀完上段文章,您一定會心生疑問,為何海洋弧菌可以感染人體,並在人體中繁殖?台灣俗話說:人肉鹹鹹。這樣您應該不難懂了。 (弧菌以後再專章介紹)


海洋細菌到陸地來會怎樣?

這個問題,應該不難解釋,有三種可能:
  1. 死了。[環境不佳死掉了(包含被藥物殺死);被滅菌釜殲滅…]
  2. 不死。[在陸地某個角落寂寞存在著;實驗室冷凍乾燥保存著….]
  3. 繁殖著。[感染人體互相傳染;在實驗室的培養基;另外末學還懷疑在所內下水道可能潛藏不少,没死的漏網之魚?…..]

玉山上的細菌西漂到台灣海峽,能活嗎? 


"海洋細菌"有感!

 "來時糊塗去時迷空在人間走一回
 未曾生我誰是我生我之後我是誰
 長大成人方是我合眼矇矓又是誰
 不如不來亦不去來時歡喜去時悲"


我是什麼人並不重要,努力存在著,並依正法行事才是王道!


台灣海洋細菌的研究 (2) 淺談好熱性細菌(thermophilic bacteria) -- 來自綠島的 T501

溫度很重要!


情境1. 你躺在我身邊,但我卻感覺不到你的溫度! 這時怎辦? 
情境2. 你躺在我身邊,但我倆互相感覺不到溫度! 這時怎辦?(請自行腦補)

可見溫度是很重要的,但這似乎跟本文無關也!


溫度是限制生物分佈的重要因子!教科書寫的,能信嗎?若不信,可反證嗎?人類不是可以活在地表任何地方嗎(活火山口,洞穴等等特殊地點先不談)?想想,若褪去身上一切裝備和衣服,不就是個裸毛族罷了,又能如何?

下表對於生命科學相關系所的學生應該都不會陌生!

群別
溫度上限 (°C)
大型生物

動物

魚類和其他水生脊椎動物
38
昆蟲
45-50
Ostracods(甲殼類動物)
49-50
​​

維管植物
45
蘚類植物
50
微生物

真核生物

原生動物
56
藻類
55-60
真菌
60-62
原核生物

(真)細菌

藍綠菌 (Cyanobacteria)
73
無氧光養生物 (Anoxygenic phototrophs)
70-73
Chemoorganotrophic / Chemolithotrophic
95
古細菌

Chemoorganotrophic / Chemolithotrophic
121
哇,原來很多種細菌可以活在高溫中,古細菌甚至可以到達121度吔,所以除了死豬不怕滾水燙之外,這些小東西居然是愈熱愈愛哦!



"好熱性微生物中最適增殖溫度介於45-65℃者,可稱為中度好熱性(moderately thermophilic)微生物,最適增殖溫度出現在65℃以上者為高度好熱性微生物(extremely thermophiles)。高度好熱性微生物中,最適增殖出現在80℃以上而60℃以下不能增殖者,為超好熱微生物(hyperthermophiles) (Brock 1985; Stetter et al. 1990)。目前已知之超好熱微生物多屬於古生菌(Archaea),分別包括在三十餘屬數十種 (這數字因為忠於原著,没改,目前已不止如此了),其中屬於好鹽性者大多分離自淺海或深海海底熱溫泉區,它們分屬於......"

以上這段話是摘自國內某知名大學者(自肥一下)的論文,文中出現 "moderately thermophilc"這組詞,雖然國際上不少人用它,但是其意涵就跟巨蛋一樣,到底多大叫 "大巨蛋"?多小的可稱為 "小巨蛋"  "中巨蛋 " 呢? 總不免有畫蛇添足之感!

當時為何會這樣寫?是的,没錯,是參考了業界專家的論述,似乎很合理地把它們的界限劃分了出來。但是當專家愈來愈多時,意見也會隨著增加,這溫度界限的爭議也就愈多。誰說了算呢?能登上期刊就算,或者出版一本暢銷大教科書,最後就會慢慢取得一些共識。在這裏,末學引用以微生物學大師 T.D. Brock 之名,集合現代四位專家重新編寫教科書所建議的劃分法,即最適溫度為45以上者為thermophilic80以上者稱之為Hyperthermophilic ,這樣簡單的區分會免去不少爭端


這本Brock巨著已經改了十多版了!

兼具好鹽和好熱兩特性的菌株 T501

菌株T501也是分離自綠島的海濱熱泉,它比Alterococcus agarolyticus 早了五年登上國際期刊!論文資料如下:







這株菌能為國際期刊發表,其特殊性自不在話下:(紅線處注意看!)






為什麼特殊?因為它的G+C ratio只有38.1%,這在好熱性細菌 (或稱:高溫細菌)是比較特殊的。照常理講GC是三鍵,AT是二鍵,前者對熱較為穏定,所以好熱性細菌DNA一般會有較高的G+C ratio。再來看看T501與其它菌種的比較如下:


Rhodothermus marinus是一株非常有名的紅色菌種,綠島也有它踪跡。


不枉費末學辛苦的參與,總算有了代價,末學的名字首度出現在國際期刊吔!可喜可賀啊..........
雖然還是小海兵,總有一天會穿上 "正義的披風。

必也正名乎?

一新的菌種要為世人所知曉,當然要有個名字 (關於命名的問題以後再來談),但這個名字又要在相關期刊發表才算數。所以T501雖然在公元1993年發表,但是它只是 "a" halophilic thermophilic bacteria ,並不像Alterococcus agarolyticus 有正式的名稱。(這也就是先在一起,並不一定會變成老婆,可能轉個身變成了小三,所以步入禮堂還不成,去戶證事務所登記了才算數!)。老大當然念茲在茲地想要把T501正式推向國際,給他一個名份,但是末學在學時忙著自己的東西,畢業後,没人接續做好熱性細菌,所以也就擱著。當末學數完饅頭,繞一圈再回來時,已經過了好幾年,這變成小三的T501到底有没有正式被命名,印像中好像没有,誰可以告訴末學?

         只在乎曾經擁有
         不在乎天長地久

是的,T501跟末學只是知暫的邂逅與接觸,但這溫度,末學是感覺得到的,或許你没有名份,但你的分身們正在綠島繼續努力的生存著。永遠祝福.....God Bless...





台灣海洋細菌的研究—番外篇 (2). 人生的救贖 - 洗濯機

微生物實驗室除試管外,清理培養皿、血清瓶和一些的大大小小玻璃,這是令人厭煩和喪心的工作!有詩為證:

       試驗完了洗刷刷
       管你腰背痛哇哇
       奴家只為那學位
       才願在此淅嘩啦

九O年代,剛好碰上台灣經濟紅不讓的時候,常言道:"酒足飯飽思淫慾" (這絕對是下下下等人的想法),但是我們老大這種有志之士是想著環境保護的問題!

一日地下室試管間出現了一部白色新機器,這是老大為體恤學生洗試管的辛勞,並為開始減量使用塑膠培養皿,改用玻璃培養皿,所添購的洗濯機 (暫稱它為 1 號),

大家研究後,一致通過1號不過是一部台製洗碗機!試用後,試管完全洗不乾淨,只能洗玻璃培養皿,當然,每次末學的量都很多,要用很多培養冊和試管,所以,試用一次後,就不再碰它了。倒是我同學哥,[他真的是一個很好的人,什麼都好,家庭幸福美滿,大女兒上台大醫科 (這邊先狗腿一下,將來看病比較方便),言教身教有方啊!] ,他就堅持使用玻璃培養皿,捨棄對環境造成傷害的塑膠培養皿,善哉,哥。當然,這樣的結果,也是老大樂見的,因為塑膠的用量減少了。但末學的部分一點都没變 (深自忏悔),所以每每看到哥洗玻璃皿的背影,就不禁想朱自清所描寫的感人情節,紅了眼眶,弗如也,末學弗如也。

1號的不好用,終於老大也認清了這個事實,為了徹底執行環保的意志,1號終於跟我們說881,取代它的是一部德國名牌BOSCH洗濯機 。哇哩咧,幾經研究,它到底還是一部洗碗機啊.....,但畢竟德國香腸比較大,所以這部可就勵害了,因為它真的有一點好用,尤其洗起盤子來,真的是有乾淨到,但洗試管還是麻煩,洗瓶子倒也很OK!相信有許多人用過它。

時序到了西元2000年后,2號怎麼掛掉?是末學使用不當,還是末學傳承不當,總是跟末學脫不了干係!某一年,所內一位教授退休,順理,老大就接收了他的辦公室,小學弟妹們從此脫離暗黑的地下室試管人生,那這2號也就請回收阿伯載走了!


試管洗濯人生有苦有樂,有截圖為證:






時代一直在進化,洗的方式約在公元2010年後,發生了改變,因為實驗室敗了一部大型超音波振盪器,所以洗的速度加快了很多!到底多快,使用者現身說明,截圖為證:




400根當年耗掉末學至少五小時,現在縮短為三十分鐘!唉....自嘆生不逢時,但誰能還我青春啊.........?




科學農業 -- 智慧型灌溉 (台南官田區)

台灣的降雨時間分配顯著不均,豐枯季分明,使得水資源調配不易。依目前氣候變遷之情勢觀察,近十餘年有年平均降雨量呈現旱、澇加劇及頻 繁 的現象,且不確定性增高,影響農業灌溉用水之營運甚鉅。 台灣農業用水包括灌溉、養殖及畜牧等三項。早期之農業用水係以水稻灌溉為主,惟 ...