台灣海洋細菌的研究之番外篇(3). 為菌嚐藥

題外

人可以粗略分為兩種，一種没有自信，另外一種是有自信(就如柯P常講：一種是有插管，另一種是没有插管的)，當然這兩類人是可以再細分，譬如有自信的人在程度上會有自信滿滿，有點自信等等的區分   (但插管的就不能分成全插或半插囉)。自信滿滿的人，有時候會變成呼六 (唬爛) 的人，他們常常會把話說滿了，但真正操作的時候，卻又胡亂瞎搞。在此呼籲，没有自信的人絕對不要進實驗室！

玻璃，心易碎

 話說，進微生物實驗室，第一要先摸清洗試管的奧義   (此處再強調一次)；第二步學會配培養基(以下簡稱：配藥)。第三接種菌株；第四…

配藥的工作，說難不難，只要照著配方走，好比煮菜一般，醬油一茶匙，鹽一小匙，糖一大匙……最後再試鹹淡口味，是否符合味覺的極佳感受。雖然這樣比喻，兩者之間還是有一些差別 (譬如：炒菜的 "火候"   很重要，配方雖對，但火候不對，就GG了)。按照培養基配方，把全部材料加入到水中溶解，最後一個步驟是調整pH (酸鹼)值 (如同試鹹淡口味)，只是這步驟必須得用酸鹼檢測計 ( pH meter ) 來探知，並用酸液或鹼液調整pH，直到符合配方的要求。

pH meter 的探針是玻璃製成的，剛進實驗室時，學長就交待要好好對待它，因為不小心，它就會跟你拜別 (當時價格NT$ 1,600，唉…〝玻璃讓心碎〞)。為了要避免不必要的困擾，每次使用它時，便會戰戰競競，但意外難免發生。在末學還是菜鳥時的幾個月內，大概壓破兩支，變成老鳥後，竟也失手又弄壞一支。根據私人統計，pH meter損壞率是一定的(與夾娃娃機的概念一樣)，由此可見，pH meter損壞常會被認真配藥的研究生給碰到 (讚嘆一下自己)。

圖左那根有黃色接頭玻璃管，就是pH meter的探針。
(懶得P圖，說真的貼上這張照片，會讓人覺得這間實驗室管理欠妥！)

為菌嚐藥

某一日，進實驗室，甲學弟告知pH meter探針頭又掛了，無法配藥，已訂了新貨，但要幾天才到，只見他收拾包袱，飄然而去。此時，瞥見實驗臺前有一位乙學弟正在配製藥品，只覺他自信滿滿令人震懾 (當年不知，現才懂得 "人到一種境界，會散發出某些能量"  ，今人難以招架)，只見他興起緩緩拾起藥匙，舀了一瓢培養液，送入口中，發出嘖..嘖..嘖的聲音，接著喊了一聲   "delicious"，放下藥匙，配製完成。當下，年輕的末學頗為驚嚇，世上竟有如此性情中人！

做過科學研究的人都知道，在試驗過程中，若有一個步驟出差錯，可能整個試驗都得重來，生命科學的試驗也一樣，非常注重再現性！培養基pH值關係到細菌的存活與增殖，所以配製培養基的SOP是師兄弟間必須傳遞和遵守的規則，這才能保證養得出細菌來。為何這專業學子，會做出這樣的事來？這疑問在末學心中縈繞許久，隨著經驗的累積終究還是解開了！

為什麼？其實，實驗室所指定的培養基成分(藥品)都是固定的，劑量也固定，品牌也固定，那麼溶入水中後，其pH值大概不會變動太大，最多就差個0.1左右了，要調整至正確值，用的酸鹼液量也就固定了，所以這個專業且自信滿滿的學弟，當年的確悟到這個原則，因此在滴入數滴鹼液後，大膽以口試藥，也表明〝人既可食，菌亦可食〞的深奧道理。至今，末學仍佩服不已。有詩讚曰：

古黔婁嘗糞憂親

今學子試藥養菌

天然混成兩難比

才子牽掛只為伊

有人會問：pH值差0.1會不會影響細菌的生長？

末學不負責任並大膽地告訴諸位，百分百會影響，但這個差別您肉眼一定看不出來，用儀器測量也在95%的信赖區間內 (這樣到底有没有影響？)。因為，除了pH值外，實際操作過程中，還有許多因素參雜其中，造成每次培養出現一些差異。

台灣海洋細菌的研究 (4) 海洋細菌怎樣培養？ How to cultivate marine bacteria?

三千弱水，只要一瓢！

「寶玉呆了半晌，忽然大笑道：『任憑弱水三千，我只取一瓢飲。』」

  林黛玉：表示……

  薛寶釵：……

這是曹雪芹在紅樓夢中，描述賈寶玉只愛唯一的情節。賈的專情並不是本文所關注的重點，一瓢弱水的生命內涵是什麼？才是微生物工作者想要知道的。

細菌培養

我們都知道這一瓢海水裏有細菌，但人的肉眼看不到，如何把它們從海水中挑出來，進行培養？一般而言，細菌的培養包含幾個工作：

1. 培養基製作：預先擬定研究的目標菌種，根據菌種特性設計培養基。  
2. 分離菌株：利用培養基，將細菌從環境(海水、底泥、鹽沼等)中分離(挑)出來。這個把細菌挑出來培養的過程，學界術語稱作：分離(isolating)。
3. 純化培養：確認所分離之菌株為純系，才會進一步執行相關的試驗。       

分離菌株的最簡單方法一般會用平版培養基，讓細菌在上面生長成一顆顆菌落
(基本上一隻細菌會進行細胞分裂，最後聚集成為一個肉眼可以見到的菌落)。

分離菌株實際操作方法與步驟如下：

1. 準備培養基：包括(緩衝)稀釋液和平板(洋菜)培養基。
2. 採樣：到海邊去，取一瓢(桶、瓶、罐、壺等等等…都可以)海水回來。
3. 利用(緩衝)稀釋液，將海水以10的倍率多個階段稀釋。(為什麼要稀釋10倍…..1000倍….？)
4. 將不同倍率稀釋後的海水，各取約0.1 mL，均勻塗抹於平板培養基上，放置於25~30度的恆溫箱中培養。
5. 培養數日後，平板培養基上會出現大大小小不同形態和顏色的菌落，挑選您合意的菌落，用連續劃線法加以純化，確認為純菌後，接種於高層培養基中，並置於20℃恆溫箱中行繼代保存；繼代保存每三～四個月進行一次。

您如果想要在茫茫大海中，找到那一個唯一最愛的菌種，除了運氣外，培養基的設計將會大大提升成功的機會。(至於怎設計？待咱另回分解！)

   

題外：弱水在那兒？

《海內十洲記》記載：鳳麟洲在西海之中央，地方一千五百里。洲四面有弱水繞之，鴻毛不浮，不可越也。洲上多鳳麟，數萬各為群。又有山川池澤，及神藥百種，亦多仙家。

《山海經．大荒西經》:西海之南，流沙之濱，赤水之後，黑水之前，有大山，名曰崑崙之丘。有神，人面虎身，有文有尾，皆白，處之。其下有弱水之淵環之，其外有炎火之山，投物輒然。有人戴勝，虎齒，有豹尾，穴處，名曰西王母。此山萬物盡有。

閱畢古人對〝弱水〞神話般的敍述，末學覺得何不把台灣周邊海域統稱為弱水呢？雖然比喻好像有點不倫不類，但是想要從台灣轄內浩瀚的海水培養出細菌，也只能如賈寶玉一般，三千弱水只取一瓢，然後運回實驗室好好瞭解了！

台灣海洋細菌的研究 (3) 海洋細菌(Marine Bacteria)怎麼說？

您哪位？(Who are you?)

台灣人是誰？誰才是台灣人？這個命題對於許多人而言，是困難回答的，因為它涉及到錯綜複雜的歷史和個人的情感問題。以法律論，大概可以擁有國籍者稱之，但這金、馬兩地又GG了？所以，請各自表述。

為什麼講海洋細菌，會談到這個敏感問題？因為末學覺得它們的爭議很相似！

無所不在的細菌

細菌是群特殊的生命，它們在天、地、水三界中無所不在，只要環境因子適合，即可任意而行，恣意而生。與其它生物一樣，"空中" 大多是它們短暫經過的地方，終將墜落於陸地或水界。尤其水界又分為陰陽 [海 (鹹)、淡]兩個分界 (這邊順提一下，大部分學者會把淡水域包含在陸域內，之後末學也會把來自此的細菌統稱為陸源細菌)，這是兩個絕對不一樣的地方，海水含有約3.7%的鈉鹽，淡水鈉鹽含量則完全讓人感覺不到它的存在。這個鈉鹽的因素，成為侷限了不同細菌種類的分布的原因之一，也是許多學者認定是否為海洋細菌參考的準則 (也是爭議的所在)。

在大多數的地方，能查到海洋微生物的定義大概都是如下寫法：

Marine microorganisms are defined by their habitat as the microorganisms living in a marine environment, that is, in the saltwater of a sea or ocean or the brackish water of a coastal estuary.

没錯！多以棲地做為區分的原則。同理可推，海洋細菌就是生存在海水域的細菌。但是對於細菌這種單細胞生物來說，"生存"這個詞也隱含著"不死"的意涵。為什麼如此解釋？在這裏需要闡明，相對於多細胞生物，細菌真的簡單多了，當環境變成嚴苛時，有些種類會死亡，但也有許多種類可以把細胞的代謝降到最低，甚至幾乎停滯的狀態(也就是“不死”，龜息大法也！)，來渡過這個階段。

陸源細菌會隨著降水、河川水等等，流入海洋，雖然海洋對於它們來說是嚴苛的環境，但許多陸源性細菌仍可以存在(不死)於海洋中，有些甚至可以不畏鈉鹽，在海水中繁殖(定居下來囉！)。

問題來了，您到海邊取一瓢海水，裏面存在的都是海洋細菌嗎？

 海洋細菌 (marine bacteria)

 下面是比較嚴謹的定義：

海洋細菌泛指能夠在海洋環境中"生存"、"繁殖"之細菌，包括好鹽性（halophilic）和非好鹽性(non-halophilic)兩大類族群，其中只有前者是以海洋為原棲地，可謂是真正的海洋原生種細菌。

1.  定義中出現"繁殖" (Growth, 末學比較喜歡用"增殖")這個概念非常重要，因為生命的意義是在創造宇宙繼起之生命 (講白話一點就是繁衍下一代)，所以要成為海洋細菌，一定要能夠在這兒落地生根。
2. 好鹽性細菌：有鈉鹽需求者，没有鈉鹽，代謝會出現問題，無法繁殖。
3. 非好鹽性細菌：没有鈉鹽需求者，有此菌種可能因某些原因，變成不需鈉鹽，另外有些種類是陸源性菌種至此定居者，但它們在海水中都可以繁殖。

海洋細菌定義的爭論點：

1. 統合納海派：來自(存在)海水的細菌，皆是海洋細菌。
2. 基本教義派：有鈉鹽需求者，也就是來自海洋的好鹽性細菌才算。
3. 邏輯學理派：就是本文所提，咱老大下的這個定義啦。

所以，您喜歡那一派？您取的那瓢海水，就各自表述了。

 海洋細菌中最著名的一群：Vibrio

 弧菌屬(Vibrio)之菌種為海洋環境中最重要的細菌群之一，約佔河口或沿岸水域中可培養異營細菌總生菌數之10-50 % (Blake et al., 1980).。它們均屬於革蘭氏陰性桿菌，在2～3％NaCl濃度下有最佳生長(Borrego et al., 1996)。Simidu & Tsukamoto（1985）指出，各種海洋弧菌在海水中的分布，大多不受地理區域的限制，但卻有依深度而分棲（habitat segregation）之傾向。它們與許多海洋生物有密不可分之關係，形成寄生、共生或其他類型之共存型式（Shieh et al., 2003），其中有些種類更是人類和多種海洋動物之致病菌，諸如瘡傷弧菌（Vibrio vulnificus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、腸炎弧菌（Vibrio parahaemolyticus,或稱副溶血弧菌）等深具感染力，可透過食用海產及各種親水活動成為腸道病原菌(Blake et al., 1980；Borrego et al., 1996；Haldy et al., 1996；Ishimaru et al., 1996；Lee et al., 2002)。

讀完上段文章，您一定會心生疑問，為何海洋弧菌可以感染人體，並在人體中繁殖？台灣俗話說：人肉鹹鹹。這樣您應該不難懂了。 (弧菌以後再專章介紹)

海洋細菌到陸地來會怎樣？

這個問題，應該不難解釋，有三種可能：

1. 死了。[環境不佳死掉了(包含被藥物殺死)；被滅菌釜殲滅…]
2. 不死。[在陸地某個角落寂寞存在著；實驗室冷凍乾燥保存著….]
3. 繁殖著。[感染人體互相傳染；在實驗室的培養基；另外…末學還懷疑在所內下水道可能潛藏不少，没死的漏網之魚？…..]

玉山上的細菌西漂到台灣海峽，能活嗎？ 

寫"海洋細菌"有感！

 "來時糊塗去時迷，空在人間走一回，

 未曾生我誰是我？生我之後我是誰？

 長大成人方是我，合眼矇矓又是誰？

 不如不來亦不去，來時歡喜去時悲！"

我是什麼人並不重要，努力存在著，並依正法行事才是王道！

台灣海洋細菌的研究 (2) 淺談好熱性細菌(thermophilic bacteria) -- 來自綠島的 T501

溫度很重要！

情境1. 你躺在我身邊，但我卻感覺不到你的溫度！ 這時怎辦？ 

情境2. 你躺在我身邊，但我倆互相感覺不到溫度！ 這時怎辦？(請自行腦補)

可見溫度是很重要的，但這似乎跟本文無關也！

溫度是限制生物分佈的重要因子！教科書寫的，能信嗎？若不信，可反證嗎？人類不是可以活在地表任何地方嗎(活火山口，洞穴等等特殊地點先不談)？想想，若褪去身上一切裝備和衣服，不就是個裸毛族罷了，又能如何？

下表對於生命科學相關系所的學生應該都不會陌生！

群別	溫度上限 (°C)
大型生物
動物
魚類和其他水生脊椎動物	38
昆蟲	45-50
Ostracods（甲殼類動物）	49-50
植​​物
維管植物	45
蘚類植物	50
微生物
真核生物
原生動物	56
藻類	55-60
真菌	60-62
原核生物
(真)細菌
藍綠菌 (Cyanobacteria)	73
無氧光養生物 (Anoxygenic phototrophs)	70-73
Chemoorganotrophic / Chemolithotrophic	95
古細菌
Chemoorganotrophic / Chemolithotrophic	121

哇，原來很多種細菌可以活在高溫中，古細菌甚至可以到達121度吔，所以除了死豬不怕滾水燙之外，這些小東西居然是愈熱愈愛哦！

"好熱性微生物中最適增殖溫度介於45-65℃者，可稱為中度好熱性(moderately thermophilic)微生物，最適增殖溫度出現在65℃以上者為高度好熱性微生物(extremely thermophiles)。高度好熱性微生物中，最適增殖出現在80℃以上而60℃以下不能增殖者，為超好熱微生物(hyperthermophiles) (Brock 1985; Stetter et al. 1990)。目前已知之超好熱微生物多屬於古生菌(Archaea)，分別包括在三十餘屬數十種 (這數字因為忠於原著，没改，目前已不止如此了)，其中屬於好鹽性者大多分離自淺海或深海海底熱溫泉區，它們分屬於......"

以上這段話是摘自國內某知名大學者(自肥一下)的論文，文中出現 "moderately thermophilc"這組詞，雖然國際上不少人用它，但是其意涵就跟巨蛋一樣，到底多大叫 "大巨蛋"？多小的可稱為 "小巨蛋"？  "中巨蛋 " 呢？ 總不免有畫蛇添足之感！

當時為何會這樣寫？是的，没錯，是參考了業界專家的論述，似乎很合理地把它們的界限劃分了出來。但是當專家愈來愈多時，意見也會隨著增加，這溫度界限的爭議也就愈多。誰說了算呢？能登上期刊就算，或者出版一本暢銷大教科書，最後就會慢慢取得一些共識。在這裏，末學引用以微生物學大師 T.D. Brock 之名，集合現代四位專家重新編寫教科書所建議的劃分法，即最適溫度為45℃以上者為thermophilic，80℃以上者稱之為Hyperthermophilic ，這樣簡單的區分會免去不少爭端。

這本Brock巨著已經改了十多版了！

兼具好鹽和好熱兩特性的菌株 T501

菌株T501也是分離自綠島的海濱熱泉，它比Alterococcus agarolyticus 早了五年登上國際期刊！論文資料如下：

這株菌能為國際期刊發表，其特殊性自不在話下：(紅線處注意看！)

為什麼特殊？因為它的G+C ratio只有38.1%，這在好熱性細菌 (或稱：高溫細菌)是比較特殊的。照常理講G和C是三鍵，A和T是二鍵，前者對熱較為穏定，所以好熱性細菌DNA一般會有較高的G+C ratio。再來看看T501與其它菌種的比較如下：

Rhodothermus marinus是一株非常有名的紅色菌種，綠島也有它踪跡。

不枉費末學辛苦的參與，總算有了代價，末學的名字首度出現在國際期刊吔！可喜可賀啊..........

雖然還是小海兵，總有一天會穿上 "正義" 的披風。

必也正名乎？

一新的菌種要為世人所知曉，當然要有個名字 (關於命名的問題以後再來談)，但這個名字又要在相關期刊發表才算數。所以T501雖然在公元1993年發表，但是它只是 "a" halophilic thermophilic bacteria ，並不像Alterococcus agarolyticus 有正式的名稱。(這也就是先在一起，並不一定會變成老婆，可能轉個身變成了小三，所以步入禮堂還不成，去戶證事務所登記了才算數！)。老大當然念茲在茲地想要把T501正式推向國際，給他一個名份，但是末學在學時忙著自己的東西，畢業後，没人接續做好熱性細菌，所以也就擱著。當末學數完饅頭，繞一圈再回來時，已經過了好幾年，這變成小三的T501到底有没有正式被命名，印像中好像没有，誰可以告訴末學？

         只在乎曾經擁有

         不在乎天長地久

是的，T501跟末學只是知暫的邂逅與接觸，但這溫度，末學是感覺得到的，或許你没有名份，但你的分身們正在綠島繼續努力的生存著。永遠祝福.....God Bless...